Влияние экспериментального десинхроноза на иммунотоксичность безапирена у мышей

Содержание мышей (CBA X C57BL)F1 в условиях круглосуточного освещения в течении двух недель приводило к развитию внутреннего десинхроноза (ДС), при котором реакции иммунной системы на воздействие бенз(а)пирена (БП) достоверно отличались от реакций интактных животных. Предполагается, что различия связаны с изменением циркадианных ритмов иммунных показателей у опытных животных, так как действие БП в контроле и при ДС приходится на различное соотношение и, возможно, функциональное состояние иммунокомпетентных клеток.

Ключевые слова: десинхроноз, бенз(а)пирен, иммунный ответ, лимфоидные органы .

Иммунная система является одним из важнейших адаптационных механизмов. Экзогенные или эндогенные факторы всегда вызывают изменения в клеточных или гуморальных звеньях иммунитета [3]. В то же время иммунная система подчиняется принципу ритмичности протекания всех биопроцессов [1, 7]. Можно предположить, что при рассогласовании по фазе циркадианных ритмов различных функций организма – десинхронозе (ДС) может измениться степень или направленность воздействия факторов. Однако влияние десинхронизации биоритмов на чувствительность/резистентность иммунной системы мало изучено. В настоящее время один из основных трендов экологического неблагополучия – это химические загрязнения, обусловливающие повышение заболеваемости на техногенно нагруженных территориях [2, 3, 5, 6], из которых по критериям ВОЗ наиболее опасным и распространенным является бенз(a)пирен (БП) [5]. БП - иммунодепрессант, влияет на процессы дифференцировки предшественников Т клеток, приводит к снижению их реакции на ИЛ-2 [5, 8]. В настоящем исследовании изучали особенности влияния БП на параметры иммунной системы мышей при индукции экспериментального десинхроноза.

Методика исследования:

Экспериментальная модель ДС: мыши (CBAxC57BL)F1 находились две недели при круглосуточном освещении [1]. Контрольные группы содержались при обычном световом режиме. На 15-й день мышей декапитировали в 10.00, 15.00 и в 19.00 часов по 5-6 животных из каждой группы в каждую временную точку для определения суточных вариаций исследуемых показателей. Оставшимся мышам обеих групп, по 6 животных в каждой группе, вводили внутрибрюшинно БП в 10.00 ч в течении 3 дней в суммарной дозе 60 мг/кг в минимальном объеме оливкового масла (0.2мл). Активным контролем служило введение минимального объема оливкового масла. Этих животных декапитировали в 10.00 ч на следующий день после 3-ей инъекции БП и оливкового масла. В крови определяли лейкоцитоз и лейкоцитарную формулу.

В лимфоидных органах определяли количество клеток, % и общее количество лимфоцитов и бластов, весовые органные индексы. Содержание различных субпопуляций лимфоцитов в тимусе и в селезенке исследовали в 10.00 ч методом проточной цитометрии с моноклональными антителами против лимфоцитарных антигенов CD3, CD4, CD8 и CD25, меченных FITC и PE (Pharmingen) на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson). Гуморальный иммунный ответ на Т-зависимый антиген – эритроциты барана (ЭБ) - определяли по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке на 4-е сутки после внутрибрюшинного введения антигена по методу Cunningham [4]. Статистическую обработку проводили с использованием пакета статистических программ “Statistica 5”. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критериям Манна-Уитни и с использованием дисперсионного многомерного анализа MANOVA при 95% уровне значимости.

Результаты исследования:

У мышей под влиянием постоянного освещения по сравнению с интактными выявлены достоверные отличия по следующим показателям. В крови повышался % лимфоцитов и снижался % полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в 10.00 ч. В тимусе повышался % лимфоцитов в 10.00 ч и 14.00 ч и снижался % бластов в 14.00 ч. В селезенке наблюдалось увеличение веса и весового индекса в 10.00 ч, 15.00 ч, 19.00 ч, общего количества спленоцитов а также лимфоцитов в 10.00 ч, 15.00 ч и бластов в 10.00 ч, 15.00 ч, 19.00 ч; в то же время % лимфоцитов снижался в 10.00 ч и в 19.00 ч, а % бластов повышался в 10.00 ч. Изменялся и характер суточных вариаций исследованных показателей (рис. 1).

Рис. 1. Влияние постоянного освещения на суточные вариации показателей иммунной системы у мышей (CBA X C57Bl)F1. Одинаковыми значками обозначены показатели, достоверно отличающиеся друг от друга при р<0,05.

Постоянное освещение повлияло и на субпопуляционный состав клеток лимфоидных органов. В тимусе снизился % зрелых Т-клеток CD3+25- (57.8±1.3 и 62.2±0.7 p<0.05), претимоцитов CD3-25+ (0.34±0.07 и 0.64±0.09 p<0.05) и клеток с рецептором к ИЛ-2 CD25+(1.7±0.2 и 2.4±0.2 p<0.05), что можно расценивать как супрессию процессов дифференцировки и активации. В селезенке, повысился % Т-хелперов CD4+ (30.5±0.8 и 22.4±1.15 p<0.01) и отношение CD4+/CD8+ (1.79±0.09 и 1.39±0.11 p=0.02). Можно предположить, что эта динамика отражает компенсаторные реакции периферических лимфоидных органов в ответ на угнетение функций центрального звена иммунитета.

Таким образом, изменения параметров иммунной системы у подопытных животных, могут свидетелствовать о развитии внутреннего десинхроноза и изменении структурно-функциональных параметров центральных и периферических органов иммунной системы при нарушении светового режима.

Влияние БП на интактных животных и при десинхронозе оказалось неоднозначно (данные представлены в табл. 1 и 2). В крови контрольных мышей БП не изменял процентное соотношение форменных элементов, а на фоне ДС снижал % лимфоцитов и повышал % ПЯЛ. В тимусе мышей контрольной группы БП снижал % Т-хелперов (CD4+), повышал % зрелых Т-клеток (CD3+25-) при снижении % претимоцитов (CD3-25+), что можно расценить как нарушение центральной дифференцировки Т-клеток с угнетением созревания Т-хелперов. При десинхронозе БП повышал % зрелых Т-клеток (CD3+25-) в большей степени, чем в контроле и не влиял на % претимоцитов (CD3-25+). Повышение % CD25+ тимоцитов, и соотношения CD4+/CD8+ можно расценить как направление дифференцировки в сторону созревания Т-хелперов, что может быть проявлением компенсаторной реакции.

В селезенке у животных контрольной группы БП не влиял на процент субпопуляций CD4+ и CD8+ и снижал вес органа. Кроме того, наблюдалась тенденция к снижению процента лимфоцитов. При десинхронозе БП снижал % Т-хелперов, общее количество спленоцитов, лимфоцитов и бластов. В брыжеечных лимфоузлах в контрольной группе БП снижал % бластов, а на фоне ДС наблюдалась только тенденция к их снижению. (Таблицы 1, 2).

Таблица 1. Влияние БП на показатели иммунной системы интактных мышей.

Показатели Группы животных
Интактныйконтроль Введениеоливкового масла Введение БП
M ± m M ± m M ± m
Вес тимуса, мг 33.0 ±2.22 31.6±3.63 25.67 ±2.09*
Бласты в тимусе,% 26.9±0.84 19.5±6.81 16.7±3.13*
CD3-25+  в тимусе, % 0.64±0.09 1.04±0.07* 0.53±0.13#
CD3+25- в тимусе, % 62.2±0.7 63.7±7.7 76.1±5.2*
CD3+  в тимусе, % 63.9±0.64 66.02±3.8 78.45. ±5.4*
CD3+ hi в тимусе, % 13.7±1.7 22.7±6.9 39.4±3.6*
CD4+  в тимусе, % 93.2±0.1 89.9±1.3 86.3±1.1*#
CD8+  в тимусе, % 87.9±1.46 76.12±4.06* 65.9±2.07*
CD4+/ CD8+ в тимусе 1.06 ±0.02 1.19±0.06* 1.31±0.03*
Вес селезенки, мг 84.5±3.62 84.4±4.37 73.17±2.72*#
Лимфоциты в селезенке, % 73.5±1.47 64.62±3.12* 61.8±7.13
Бласты в лимфоузлах,% 29.9±3.17 14.06±3.13* 16.23±2.35*

Примечание: * - достоверные отличия от интактного контроля, # -достоверные отличия от “активного контроля” (введение оливкового масла) при p<0,05.

Таблица 2. Влияние БП на показатели иммунной системы мышей в состоянии десинхроноза.

Показатели Группы животных
Постоянный свет Постоянный свет и оливковое масло Постоянный свет и БП
M ± m M ± m M ± m
Лимфоциты в крови,% 84.0±1.12 80.17±3.2 73.0±3.5*
ПЯЛ в крови, % 8.7±0.7 15.0±2.56* 22.5±2.9*
Лимфоциты в тимусе, % 72.5±2.7 56.1±2.5* 66.7±3.8#
CD3-25+  в тимусе, % 0.34±0.07 0.35±0.06 0.58±0.18
CD3+25- в тимусе, % 57.8±1.3 56.3±3.6 73.3±5.1*#
CD3+25+  в тимусе, % 1.4±0.2 1.05±0.2 2.48±0.5*#
CD25+  в тимусе, % 1.7±0.2 1.4±0.2 3.05±0.4*#
CD3+  в тимусе, % 61.2±1.9 57.3±3.8 75.8±5.45#*
CD3+hi  в тимусе, % 13.2±0.5 15.6±0.34* 58.05±8.2*#
CD8+  в тимусе, % 86.2±0.6 85.0±0.6 48.3±7.02*#
CD4 +/ CD8+ в тимусе 1.08±0.01 1.07±0.04 1.84±0.26*#
Количество спленоцитов ´ 106 861.5±88.9 840.0±114.6 248.03±52.2*#
Лимфоциты в селезенке ´ 106 583.0±60.0 565.4±85.2 159.4±33.0*#
Бласты в селезенке ´ 106 239.6±29.4 138.4±45.5 45.5±13.2*#
CD4+ в селезенке, % 30.5±0.8 31.7±1.7* 28.1±0.5#
Бласты в лимфоузлах,% 30.9±1.97 16.7±2.3* 25.1±4.3

Примечание: * - достоверные отличия от интактного контроля, # -достоверные отличия от “активного контроля” (введение оливкового масла) при p<0,05.

БП подавлял гуморальный иммунный ответ на ЭБ у интактных мышей и не оказывал достоверного влияния на этот показатель при десинхронозе, хотя тенденция к снижению сохранялась (Рис.2).

Рис.2. Количество антителообразующих клеток в селезенке на 4-е сутки после иммунизации ЭБ у мышей (CBA X C57Bl)F1 при нормальном световом режиме и при постоянном освещении.

* - показатели достоверно отличаются друг от друга при р<0,05.

Можно предположить, что неодинаковое влияние БП на иммунную систему мышей интактных и в состоянии десинхроноза связано с различиями циркадианных ритмов иммунных показателей у этих групп животных. В результате этого действие БП в контроле и при десинхронозе, вероятно, приходится на различное соотношение и функциональное состояние иммунокомпетентных клеток.

А.В. Шурлыгина, С.В. Мичурина, Л.В. Вербицкая, Е.В. Мельникова, М.В. Битхаева, В.А. Труфакин. ГУ НИИ Клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, ЦНИЛ Новосибирской Государственной медицинской академии МЗ РФ, г. Новосибирск.

Литература:

  1. Бородин Ю.И., Труфакин В.А., Летягин А.Ю., Шурлыгина А.В. Циркадные биоритмы иммунной системы. - Новосибирск, РИПЭЛ. - 1992.
  2. Гичев Ю.П. Загрязнение окружающей среды и здоровье человека. М., Новосибирск. - 2002.
  3. Дмитриев Д.А., Румянцева Е.Г. // Гиг. и сан. - 2002. - №3. - С.68-71.
  4. Козлов В.А., Кудаева О.Т., Наумова Е.Н., Елисеева Т.В. Методическое руководство по применению метода локального гемолиза и статистическому оцениванию результатов. Методические рекомендации. – Новосибирск. - 1988.
  5. Колесников С.И., Мичурина С.В., Семенюк А.В., Вакулин Г.М. Печень и ее регинарные лимфатические узлы при воздействии 3,4-бензпиреном. – Новосибирск. - 1995.
  6. Коньшина Л.Г., Вараксин А.Н., Шершнев В Н. и др. // Гиг. и сан. - 2002. - №2. - С.52-54.
  7. Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., Дергачева Т.И. и др. // Вестн. РАМН. - 1999. - №4. - С. 40-43.
  8. Rodriguez J.W., Kirlin W.G., Wirsiy Y.G. et al. // Immunopharmacol. Immunotoxikol. -1999. - V.21. - №2. - P.379-396.